平板克隆形實(shí)驗(yàn)步驟

1、細(xì)胞懸液制備:取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，用0. 25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細(xì)胞，離后用*培養(yǎng)基重懸,制成細(xì)胞懸液。

2、細(xì)胞種板:將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，以每皿50、100、 200、 500、1000、 2000個細(xì)胞的梯度密度分別接種含1 ml 37 C預(yù)熱培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細(xì)胞分散均勻。置37 C 5% Co2的環(huán)境下，靜置培養(yǎng)。

3、細(xì)胞觀察:顯微鏡下觀察到單個細(xì)胞長到20個以上細(xì)胞克隆，培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去.上清液，用PBS小心浸洗2次。加純甲醇1ml,固定15分鐘。然后去固定液,加適量Giemsa應(yīng)用染色液染10分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥，手記拍照采集圖像。

4、克隆計數(shù):用肉眼直接計數(shù)克隆數(shù)，后計算克隆形成率。

結(jié)果分析

平板克隆克隆形成率=克隆數(shù)接種細(xì)胞數(shù)x100%